Gradiente para seccionar o fluxo de trabalho CUBE para a geração e geração de imagens de organoides com diferenciação localizada

Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 299 (2023) Citar este artigo

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Avanços na cultura de organoides levaram a vários mini-órgãos in vitro que imitam tecidos nativos de várias maneiras. No entanto, o gargalo permanece para gerar organoides complexos com padronização do eixo do corpo, bem como manter a orientação dos organoides durante os processos de análise pós-experiência. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para cultivar organoides com gradiente de morfogênio usando um dispositivo de cultura CUBE, seguido de amostras de corte com o CUBE para reter informações sobre a direção do gradiente. Mostramos que os esferóides hiPSC cultivados com dois meios de diferenciação separados em extremidades opostas do CUBE resultaram em expressões localizadas dos respectivos marcadores de diferenciação, em contraste com a distribuição homogênea de marcadores nos controles. Descrevemos também os processos de seccionamento de crio e parafina de esferóides no CUBE para reter informações de orientação de gradiente. Este fluxo de trabalho de cultura de gradiente para seccionamento com CUBE pode fornecer aos pesquisadores uma ferramenta conveniente para gerar organoides cada vez mais complexos e estudar seus processos de desenvolvimento in vitro.

Células-tronco pluripotentes (PSCs) e organoides derivados delas oferecem uma maneira pragmática de modelar e estudar a formação de tecidos e órgãos durante o desenvolvimento humano inicial, pois espécimes reais representam questões éticas desafiadoras1,2,3,4. Os protocolos para gerar os vários organoides que imitam tecidos nativos geralmente dependem da manipulação sequencial da ativação ou inibição de vias de sinalização como Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt ou BMP em diferentes pontos de tempo para induzir diferenciação para linhagens específicas, como no geração dos organoides intestino5, rim6 e pulmão7, epiblastos8,9 e gastrulóides10.

No entanto, controlar o crescimento e a diferenciação de células ao longo de um eixo corporal continua sendo um desafio em culturas de organoides 3D. In vitro, o padrão ântero-posterior e dorsal-ventral em organoides pode surgir por auto-organização celular11,12, ou obtido pela fusão de organoides diferenciados separadamente como um conjunto, como em organoides cerebrais com diferentes regiões do cérebro ou organoides biliares com fígado, órgãos biliares componentes do trato e do pâncreas13,14. A limitação desses métodos, porém, é que, como as células são cultivadas em um único meio uniforme, o nível de controle em termos de informação espacial fornecida às células é bastante baixo; todas as células dentro do grupo de células que compõem o organoide recebem as mesmas pistas de diferenciação das moléculas de sinalização no meio. In vivo, por outro lado, gradientes de concentração de morfogênios de outras fontes também contribuem para governar para onde as células vão e qual fenótipo ou padrão elas devem adotar durante o desenvolvimento15,16. Por exemplo, a formação do tubo neural depende de sinais da notocorda e da camada ectodérmica não neural17, e os néfrons do rim se desenvolvem pela troca de vários sinais entre o broto ureteral e o mesênquima metanéfrico18. Assim, existe a necessidade de replicar gradientes de morfogênio para gerar organoides que se assemelhem mais aos tecidos nativos in vivo.

Várias tecnologias de engenharia foram desenvolvidas para simular o fornecimento de gradiente espacial de moléculas de sinalização para células in vitro. PSCs projetados para expressar Sonic Hedgehog (Shh)19 ou esferas de agarose embebidas em morfogênios20 podem ser colocados perto do organoide em desenvolvimento e a difusão de moléculas da fonte para as células em diferenciação criou um gradiente de concentração de morfogênios de alto a baixo. Além disso, vários transwells e microdispositivos modificados que permitem que as células sejam cultivadas com dois compartimentos de mídia separados também foram desenvolvidos para gerar gradientes de morfogênio em direções opostas nas células21,22,23,24,25,26. No entanto, essas tecnologias têm desvantagens: (1) requerem procedimentos complicados de preparação e configuração que não são fáceis de executar na maioria dos laboratórios de biologia sem habilidades e equipamentos especializados, (2) falta de controle sobre a colocação e posicionamento do amostra no dispositivo e (3) é difícil recuperar a amostra do dispositivo após o experimento para análises posteriores sem causar muitos danos à amostra ou perder a orientação da amostra. Em particular, a capacidade de reter informações sobre a orientação do gradiente a que as células foram submetidas é fundamental para garantir a análise adequada da amostra.